Biokimia Nutrisi (Darah)

Tinjauan Pustaka

Klik gambar untuk memperbesar

Darah terdiri dari plasma darah dan unsur seluler. Unsur-unsur seluler tersebut terdiri dari sel darah merah, sel darah putih dan keeping darah.

Sel darah merah sering disebut eritrosit, sel darah putih disebut leukosit, sedangkan keping darah sering disebut trombosit. Darah memiliki beberapa fungsi yaitu: membawa nutrien yang telah disiapkan oleh saluran pencernaan menuju jaringan tubuh, membawa oksigen dari paru-paru ke jaringan, membawa karbondioksida di jaringan ke paru-paru, membawa produk buangan dari berbagai jaringan menuju ginjal untuk diekskresikan, membawa kelenjar hormon endokrin ke organ-organ lain di dalam tubuh, berperan dalam pengendalian suhu dan berperan dalam mempertahankan keseimbangan air. (Frandson, 1992).

Fase cair yang tertinggal pada saat darah membeku (mengalami koagulasi) dinamakan serum. Serum tidak lagi mengandung faktor pembekuan (termasuk fibrinogen) yang normalnya terdapat di dalam plasma tetapi sudah terpakai dalam proses koagulasi (Murray, 1999).

Cara memperoleh serum yaitu darah dibiarkan 15 menit agar menjendal sehingga fibrinogennya tidak terdapat dalam cairan darah kemudian disentrifuge dan didapatkan serum (Dawiesah, 1988).

Enzim dalam darah dikelompokkan menjadi enzim yang fungsional dan enzim yang non fungsional. Enzim yang fungsional adalah enzim yang substratnya terdapat dalam darah contohnya lipoprotein lipase, sedangkan enzim yang non fungsional dalam darah dengan sendirinya tidak berfungsi dalam darah artinya substratnya tidak ada dalam darah (Girindra, 1988).

Kadar glukosa darah dapat dipengaruhi oleh beberapa factor diantaranya adalah umur, kadar energi pakan dan kondisi stres. Stres pada ayam petelur dapat disebabkan oleh kondisi kandang yang kurang nyaman. Pada kondisi stres, sekresi costicosterone meningkat sebagai akibat dari aktifitas adrenocorticotropic hormone (ACTH) (Peebles et al., 1997).

Kandungan kolesterol dalam darah ayam berkisar antara 102 sampai 123 mg/100 ml (Ramanoff, 1983). Peningkatan kadar kolesterol dalam darah merupakan faktor utama penyebab terjadinya atheroskerosis (Pelkonen et al., 1977 ; Winarno 1984). Konsumsi lemak makanan terutama lemak jenuh dan kolesterol merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi konsentrasi kolesterol dalam serum (Martin, 1983).

Materi dan Metode

Materi

Alat. Alat yang digunakan pada praktikum darah ini adalah tabung reaksi dan raknya, pipet tetes, alat penggojok, spektofotometry, waterbath, gelas ukur.

Bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum darah antara lain larutan protein standar, plasma danblanko, larutan lowry ß-1,4-glukanase, lowry A, aquades, plasma darah, Ba(OH)₂ 0,3 N, ZnSO₄ 5%, glukosa anhidrat, reagensia nelson, arsenol molibdat, Cu₂O, larutan aseton alkohol, khloroform, asam sulfat pekat, asetat anhidrit.

Metode

Penentuan Kadar Protein Darah (Metode Lowry)

Menyiapkan tiga tabung reaksi yang masing-masing diisi 0,5 ml larutan protein standar, plasma dan blanko. Ditambahkan ke dalam masing-masing tabung 2,5 ml larutan lowry B, divortex dan dibiarkan 10 menit. Kemudian, ditambahkan larutan lowry A 0,25 ml, divortex dan biarkan 30 menit. Lalu, dibaca pada panjang gelombang 570 nm dan dihitung dengan menggunakan rumus:

Kadar protein = (Abs sampel/Abs standar) x kadar protein standar x pengenceran

Penentuan Kadar Glukosa Darah (Metode Nelson-Somogyi)

Tahap Pengendapan Protein. Meletakkan 0,5 ml plasma darah ditambah 1,5 ml aquades ditambah 1,5 ml Ba(OH)₂ 0,3 N ditambah 1,5 ml ZnSO₄ 5% dan digojok. Kemudian, disentrifuge pada 3000 rpm selam 15-20 menit. Lalu supernatan yang dihasilkan digunakan untuk percobaan tahap penentuan glukosa.

Tahap Penentuan Glukosa. Membuat larutan glukosa standar (10 mg glukosa anhidrat/100 ml (BM=180), karena memakai glukosa monohidrat (BM=198) maka 11 mg glukosa/100 ml). Lalu dari larutan glukosa standar, dilakukan beberapa pengenceran, sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi 2,4,6,8 dan 10 mg/ 100 ml larutan. Disiapkan 7 buah tabung reaksi, 5 buah tabung diisi larutan standar, 1 tabung diisi sampel dan 1 tabung diisi blanko, masing-masing sebanyak 1 ml. Lalu, ditambahkan ke dalam masing-masing tabung 1 ml reagensia nelson dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 20 menit. Diambil dan didinginkan secara bersama-sama pada air dengan suhu ruang (25 °C). Setelah semua endapan Cu₂O larut sempurna dengan penambahan 1 ml arsenol molibdat, ditambahkan 7 ml aquades dan divortex. Kemudian dibaca pada panjang gelombang 540 nm. Dibuat kurve standar dan ditentukan kadar glukosa.

Pentuan Kadar Kholesterol Darah. Dimasukkan dalam tabung sentrifuge yang berisi 10 ml larutan aseton alkohol (1:1) 1 ml sampel, tabung direbus hingga larutan mendidih. Disentrifuge 3000 rpm selam 15 menit, supernatan diambil kemudian diuapkan pada waterbath mendidih hingga tinggal residunya. Dilakukan pengenceran dengan khloroform. Residu ditambah 2 ml khloroform ditambah 2 ml campuran (asam sulfat pekat : asetat anhidrit = 1 : 30), divortex. 2 ml larutan standar (2 mg kholestrol /1 ml khloroform) ditambah 2 ml campuran asam sulfat pekat dan asetat anhidrit, divortex. Blanko: 2 ml khloroform ditambah 2 ml campuran sulfat pekat dan asetat anhidrit, divortex. Dimasukkan ke dalam ruang gelap. Lalu, dibaca pada panjang gelombang 680 nm setelah warna berubah menjadi hijau dalam waktu 10 menit. Kemudian dimasukkan dalam persamaan

Y = 0,034190303 + 26,861515 X, dan X dalam mg/100 mg (%).

Hasil dan Pembahasan

Penentuan kadar glukosa darah

Tujuan praktikum ini adalah untuk dapat mengetahui kadar glukosa darah pada ayam. Prinsip kerjanya adalah pada sebuah tabung reaksi dituangkan sampel darah ayam ditambah dengan aquadest dan Ba(OH)₂ 0,3 N, kemudian divortexs. Tujuan dari divortexs ini adalah untuk membentuk filtrat Zn barium pada Ba(OH)₂. Kemudian ditambah dengan ZnSO₄ 5% dan diaduk, lalu disentrifuge pada 3000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan endapan dengan filtratnya. Kemudian blanko dibuat dengan cara yang sama dan mengganti sampel dengan aquadest. Dibuat larutan induk glukosa dengan kadar 10 mg/100 ml kemudian dibuat larutan standar. Kemudian ditambah dengan reagen nelson dan di vortex, lalu dipanaskan salama 20 menit dan didinginkan. Hasilnya terdapat endapan biru muda. Fungsi penambahan reagen nelson adalah untuk mengetahui adanya Cu dalam darah yang akan membentuk reaksi warna pada glukosa. Kemudian ditambah dengan arseno molibdat dan di vortex, ditambah dengan H₂O dan divortex kembali dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 560 nm. Pada saat penambahan reagen arsenomolibdat terjadi perubahan warna menjadi hijau kekuning-kuningan. Uji ini positif jika berwarna biru. Dari hasil penelitian menunjukkan warna kekuning-kuningan yang berarti uji tersebut negatif. Hasil yang didapat kadar glukosanya yaitu 1,39691578 mg/ml dengan absorbansi 0,123.

Menurut Peebles et al., (1997), kadar glukosa darah dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yang antara lain adalah umur, kadar energi pakan, dan kondisi stress. Pada kondisi stress, sekresi conticosterone meningkat sebagai akibat dari aktivitas adrenocorticotropic hormone (ACTH). Menurut Palvadolpirod dan Thaxton (2000), bahwa meningkatnya corticosterone dapat mengakibatkan kadar glukosa darah meningkat sebagai akibat glukoneogenesis. Kadar glukosa darah pada ayam menurut packham (1982), berkisar antara 200 mg/100 ml-250 mg/100 ml.

Penentuan kadar protein darah

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui kadar protein darah yang terkandung dalam darah ayam. Prinsip kerjanya adalah dengan disiapkan tabung reaksi diisi dengan aquadest untuk blanko dan dua tabung diisi dengan plasma darah dengan pengenceran 600 kali. Dilakukan pengenceran supaya absorbansinya dapat terbaca. Kemudian ditambah dengan reagen lowry B, divortex dan dibiarkan 10 menit.fungsi penambahan reagen ini adalah untuk mengikat N dalam protein darah karena mengandung sejumlah CuSO4. Kemudian ditambah reagen lowry A, di vortex dan dibiarkan selama 30 menit. Fungsi penambahan reagen ini adalah untuk mengoksidasi asam amino tirosin. Lalu pada menit ke 30 dibaca pada panjang gelombang 750 nm. Hasilnya warna menjadi biru. Jadi dapat dikatakan bahwa uji ini positif karena mengandung protein darah. Kadar protein darah pada praktikum ini adalah 101,6478 mg/ml dengan absorbansi 0,362.

Menurut Page (1985), bahwa protein yang ada pada darah yaitu albumin, a globulin, dan fibrinogen. Albumin berfungsi untuk mempertahankan tekanan osmosit dalam jaringan sedangkan a globulin berfungsi untuk membentuk sistim pertahanan terhadap protein aktin dan anti gen. fibrinogern adalah begian dari plasma darahg yang berfungsi pada pembekuan darah atau penggumpalan darah. Kadar normal protein darah pada ayam adalah mengandung albumin berkisar antara 16-20 mg/dl, globulin 23-33 mg/dl,sehingga totalnya adalah berkisar antara 40-52 mg/dl.

Penentuan kadar kholesterol darah

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk menentukan kadar kholesterol dalam darah yang terkandung dalam darah ayam. Prinsip kerjanya adalah tabung yang berisi plasma darah dan asetol alkohol divortex kemudian disentrifuge 3000 rpm. Fungsi penambahan aseton alkohol adalah untuk mengikat lemak yang ada. Larutan ini disentrifuge untuk memisahkan endapan dengan filtratnya, kemudian divortex agar terbentuk filtrat. Lalu tabung direbus sampai mendidih dan didinginkan sampai dingin dalam suhu kamar. Kemudian disentrifuge 3000 rpm selama 15 menit. Fungsi direbus adalah untuk memisahkan air dengan lemak. Supernatan dimasukkan dalam tabung dan diinkubasi daqlam waterbath sampai seluruh aseton alkohol menguap. Residu dalam tabung ditambah dengan khloroform dan divortex. Fungsi dari penambahan khloroform adalah untuk mempercepat reaksi. Larutan kholesterol dalam khloroform diencerkan dengan campuran asam sulfat dengan asetat anhidrat dengan perbandingan 1:30. Fungsi dari pengenceran adalah untuk memisahkan darah dengan lemak dan untuk memecah ikatan khloroform. Blako dibuat dengan menggunakan campuran 2 ml khloroform dengan asetat anhidrat. Tabung ditempatkan dalam ruang gelap selama kurang lebih 15 menit sampai terbentuk warna hijau. Kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 680 nm. Kadar kholesterol dalam praktikum ini didapat 1,82579.10¯³mg/ml, dengan absorbansi 0,084.

Kandungan kholesterol pada darah ayam adalah berkisar antara 102-123 mg/100ml (Romanof, 1983). Konsentrasi kholesterol dalam serum bervariasi dipengaruhi oleh umur, jenis kelamin, pakan, total energi, temperatur lingkungan,konsentrasi kholesterol dalam bahan pakan (William, 1974)

Menurut Poole et al., (1987), bahwa konsentrasi kholesterol yang tinggi dalamdarah dapat menyebabkan pembentukan endapan pada pembuluh darah yang dapat menyebabkan penggerusan arteri sehingga tekanan darah menjadi tinggi. Sedangkan menurut martin et al. (1983), bahwa konsumsi lemak makanan terutama lemak jenuh dan kholesterol dapat menjadi salah satu faktor yang mempengaruhi konsentrasi kholesterol dalam serum.

Penentuan kadar kreatinin

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengendapkan kreatinin dalam darah. Prinsip kerjanya adalah dengan mencampurkan 4 ml plasma dengan campuran tungstat-sulfat 0,5 N dengan perbandingan 1:8, dan disentrifuge selama 15 menit. Kemudian filtrat dibagi menjadi dua, kemudian ditambah dengan larutan standar dan campuran dari asam pikrat jenuh dengan NaOH 10% dengan perbandingan 5:1. Kemudian divortex dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit dan dibaca pada panjang gelombang 520 nm. Asam pikrat jenuh ini bereaksi dengan NaOH membentuk kreatinin pikrat dan uji positif akan membentuk warna jingga. Dari hasil praktikum kadar kreatinin adalah 0,015466034 n mol/ml dengan absorbansi 0,035. Menurut Harper et al., (1980), bahwa kadar kreatinin dalam serum atau darah sebesar 0,7 sampai1,5 ml/dl sedangkan menurut Swenson (1993), bahwa kadar kreatinin dalam darah ayam adalah berkisar antara 1 sampai 2 ml/dl.

Kesimpulan

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa kadar glukosa darah pada ayam adalah 1,39691678 mg/ml dengan absorbansi 0,123. Kadar pratein darahnya adalah 0,03538 mg/ml dengan absorbansi 0,362. Kemudian kadar kholesterol darahnya adalah 0,00182579 mg/ml dengan absorbansi 0,165. Sedangkan kadar kreatinin darahnya adalah 0,015466034 n mol/ml dengan absorbansi 0,035.

Tinggi rendahnya glukosa darah, kreatinin darah, protein darah dipengaruhi oleh umur, kandungan energi pakan, jenis kelamin, dan kondisi stress. Sedangkan kadar kholesterol darah dipengaruhi oleh umur, konsenterasi lemak makanan, total energi makanan, dan temperatur lingkungan.

Lampiran

Perhitungan

Penentuan kadar glukosa darah

Absorbansi = 0,123

Y = 0,00524+0,0843 X

0,123 = 0,00524+0,0843 X

X = 0,11776

        0,0843

   = 1,39691578 mg/ml

Penentuan kadar protein darah

Absorbansi = 0,362

Y = 0,33+1,942 X

X = y-0,033 . 600

            1,942

   = 0,362-0,033 . 600

            1,942

   = 101,6478 mg/ml

Penentuan kadar kholesterol darah

Absorbansi = 0,084

Y = 0,36+1,942 X

X = y - 0,036

            26,29

   = 0,00182579 mg/ml

Penentuan kadar kreatinin darah

Absorbansi = 0,035

Filtrat          = 1 ml

Pemekatan  = 2,5

                         Filtrat

                        = 2,5/1 = 2,5

Y = 0,0222+0,33104921 X

X = y - 0,0222

      0, 331049

   = 0,038665087 ? mg/ml

Kreatinin =   

                = 0,015466034

Daftar Pustaka

Borgman, R. F. and F. Wardlow. 1985. Serum Cholesretol Consentration and Cholithiasic in Rabbit as Influenced by Diatory.

Dawieasah, S. 1988. penentuan Nutrien dalam Jaringan dan Plasma Darah. UGM. Yogyakarta.

Frandson, R. D. 1992. Anatomi dan Fisiologi Ternak. Edisi keempat. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Girindra, A. 1988. Biokimia Patologi Hewan. Pusat Antar Universitas IPB bekerjasama dengan Lembaga Sumber Daya Informasi IPB. Bogor.

Harper, H A. Rodwell, V W. D A Mayes. 1980. Biokimia Review of BiologicalChemistry. Lange Medical Publication. California.

Martin, D. W., P.A. Mayer and V. W. Rodwell. 1993. Biokimia. 19^th ed. EGC. Jakarta.

Murray, R. K. 1999. Biokimia. Edisi 24. Penerbit buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Packam, R. G. 1982. Feed Composition, Formulation and Poultry Nutrition A Courie Manual and Growth. Australian University International Development Program (AUIDP). Australian Vice Chancelors Comm. Sydney.

Page, D. S. 1985. Prinsip-Prinsip Biokimia. Edisi kedua. Erlangga. Jakarta.

Peebles, E. D. A, A. L. Pond., J. R. Thompson., C. D. Mc Daniel., N. M. Cox and M. A. Latour. 1997. Haloxonp Attenuates serum corticosterone and augments serum glucose concentrations in broiler stimulated with adrenocorticotropin. Poultry Science.

Pelkonen, R. E., E. A. Nikkila., S. Kaskonen., K. Penttinen and S. Saria1887. Asociation of Serum Lipids and Obesity With Cardiovaskuler Mortality. Br Med. J. 2: 1185.

Poole, Jr W. J., S. R. Shimer., Dunlop and W. E. Urban Jr. 1987. Effects of Methionine Suplementation on Experimental Artherusclerosis in Rabbit. New York.

Puvadolprilod, S and J. E. Thaxton. 200. Model of Physilogical Stress in Chickens 4.Digestion and Metabolism. Poultry Science.

Romanoff, A. L and A. J. Romanoff., 1993. The Avian Egg. 2^nd Editon.John Willey AndSons, Inc. New York.

Soliman, K. F. A. and T. M. Huston. 1984.Effect of dietary protein and fat on the plasma cholesterol and packed cell volume of chicken exposed to different environment temperature. Poultry Science. 53; 161-166.

Swenson, M. S. 1993. Physilogical Property and Chemical Constituen of Blood, in Dukes Physology of Domestic Animal. 9^th Ed. Comstock Publising Asosiates A Division of Corneil University Press. London.

Williams, R. H. 1984. Text book of Endocrinology. 5^th ed. W. B. Soonders Co. Philadelphia. London.