Genetika (Isolasi DNA)

Isolasi DNA

Klik gambar untuk memperbesar

Materi dan Metode

Materi

Alat. Alat yang digunakan antara lain inkubasi; mikropipet (20 ml, 200ml, dan 100ml), rak eppendorf, eppendorf, gunting, bluetip, yelowtip, sentrifuge.

Bahan. Bahan yang digunakan dalam percobaan ini antara lain sampel telinga hewan, larutan DNA, lysis buffer, proteinase K, NaCl, isopropanol, ethanol (Et-OH 70%), DDW (double Destilation Water).

Metode

Persiapan isolasi DNA. Menghancurkan sel hewan dengan menggunakan sempel jaringan telingga, masukkan potongan jaringan telinga 2cm ke dalam tabung eppedorf 1,5 ml, kemudian tambahkan 730 µl DNA lysis buffer dan 10 µl protease K (20 mg/ml). inkubasi pada suhu 55⁰C selama lebih dari 12 jam.

Isolasi DNA. Tambahkan 250 µl NaCl 5M pada sempel jaringan telinga yang sudah hancur; sentrifus selama 10 menit 4⁰C 12.000 rpm; ambil 750 µl larutan bagian atas dengan blue tip yang dipotong ujungnya; masukkan ke eppendorf baru, tambahkan 500 µl isopropanol; sentrifuge selama 10 menit 4⁰C 12.000 rpm sampai terbentuk benang DNA; tambahkan Et-OH 75% 1 ml kemudian sentrifus selama 5 menit 4⁰C 12.000 rpm; buang larutan dan keringkan degan membalik tabung yang berisi DNA diatas tisu; tambahkan DDW 500 µl kemudian inkubasi 37⁰C selama 2-12 jam; terakhir dilakukan visualisasi pemotongan pita DNA.

Hasil dan Pembahasan

Perubahan struktur kromosom Perubahan jumlah ataupun struktur kromosom disebut juga mutasi kromosom. Perubahan struktur kromosom antara lain , delesi yaitu mutasi kromosom di mana sebagian dari kromosom menghilang, duplikasi adalah mutasi kromosom di mana sebagian dari kromosom mengalami penggandaan (duplikasi), translokasi adalah tersusun kembalinya kromosom dari susunan sebelumnya, dan inversi adalah penyusunan kembali materi genetik kromosom tetapi terbalik dari susunan sebelumnya (Hardjosubroto,1998).

Pengenalan analisis DNA Persiapan Isolasi DNA. Pertama dilakukan preparasi sampel. Jaringan telinga sel hewan dihancurkan dengan cara penambahan DNA lysis buffer dan Proteinase K. Penambahan DNA lysis buffer berfungsi untuk mengahancurkan jaringan telinga dan Proteinase K digunakan untuk hidrolisis protein. Enzim retriksi dapat digunakan untuk memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas (Campbell, 2000). Larutan lalu di inkunbasi pada suhu 55⁰C selama 12 jam. Pengaturan suhu dan waktu sedemikian bertujuan agar enzim Proteinase K dapat bekerja secara optimal. Hasil dari preparasi Isolasi DNA adalah larutan yang berisi jaringan telinga yang telah hancur warnanya adalah kuning bening. Jika suatu larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau dibubuhi alkali yang kuat, maka hubungan hidrogen itu menjadi labil dan putus. Dua pita spiral DNA itu membuka. Proses ini dinamakan Denaturasi DNA (Suryo, 1994).

Sampel jaringan hewan dari preparasi ditambah dengan NaCl yang berfungsi untuk mengikat DNA. Larutan lalu di sentrifuge selama 10 menit yang menghasilkan terbentuknya 3 lapisan pada larutan. Tiga lapisan yang terbentuk yaitu lapisan atas adalah lemak, lapisan tengah adalah sampel, dan lapisan bawah adalah kotoran. Lapisan atas dan tengah diambil dengan blue tip yang dipotong ujungnya dimasukan eppendorf baru. Pemotongan ujung blue tip bertujuan agar kotoran bila ikut masuk bisa dikeluarkan. Larutan ditambah isopropanol yang akan mengendapkan DNA menjadi 2 lapisan. Larutan disentifuge lagi untuk membentuk benang-benag DNA. Larutan dibuang dan dikeringkan diatas tissue lalu ditambah ET-OH. Penambahan ET-OH bertujuan untuk membersihkan dari larutan sebelumnya yang masih tersisa. Disentrifuge lagi dan ditambah DDW (Double Destilation Water) yang berfungsi untuk melarutkan DNA. Larutan kemudian disimpan dengan suhu 4⁰C selama 12 jam. Larutan yang kemudian didinginkan kembali dan dinetralisir secara perlahan-lahan, maka terbentuklah pasanganpasangan basa itu kembali. Peristiwa ini dinamakan renaturasi (Suryo, 1994).

Reaksi rantai polimerase (PCR) menklon DNA seluruhnya secara in vitro. PCR digunakan untuk membuat banyak salinan segmen DNA tertentu secara tepat. Metode yang diotomatisasi dengan mudah ini menggunakan primer yang mengurung urutan yang diinginkan dan DNA polimerase resisten panas yang khusus (Campbell, 2000).

Visualisasi DNA

PCR (Polymerase Chain Reactions). Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase (Anonim, 2011).

Komponen PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

Primer. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang diinginkan (Anonim, 2011).

dNTP (deoxynucleoside triphosphate). dNTP atau building blocks sebagai „batu bata? penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP(Anonim, 2011).

Buffer. Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase (Anonim, 2011).

Ion Logam. Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja sedangkan ion logam monovalen adalah kalsium (K+) (Anonim, 2011).

Tahapan Reaksi

Klik gambar untuk memperbesar

(Anonim, 2011).

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

a. Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96^oC selama 30-60detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal (Anonim, 2011).

b. Annealing

Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60°C selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer (Anonim, 2011).

c. Ekstensi/elongasi

Tahap ini dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72°C. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp. Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

d. Pra-denaturasi

Tahap ini dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu) (Anonim, 2011).

e. Final Elongasi

Tahap ini biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72^oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR (Anonim, 2011).

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisma mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa digunakan untuk mendeteksi diversitas genetic, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi, asal dan evolusi suatu spesies, genetic drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging gen, mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA (Anonim, 2011).

Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi : 1) Isolasi DNA, 2) pemotongan dengan enzim restriksi (digesti restriksi) dan elektroforesis gel, 3) transfer DNA dengan Southern blotting, 4) hibridisasi DNA (Anonim, 2011).

Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum yang dilakuan pada acara isolasi DNA dapat disimpulkan bahwa proses isolasi DNA pertama dilakukan prepasi sampel yaitu dengan penambahan DNA lysis buffer dan proteinase K pada sampel dan diinkubasi selama lebih dari 12 jam pada suhu 55°C yang bertujuan untuk menghancurkan dinding sel dan mendenaturasi protein. Proses selanjutnya yaitu bertujuan untuk dapat memisahkan DNA, mengendapkan dan membersihkan DNA dari larutan selain DNA yaitu dengan penambahan berbagai larutan seperti NaCl, isopropanol, dan etanol (Et-OH 70%) serta dilakukan sentrifuge untuk memisahkan larutan.

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: Isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, diekstraksi dalam larutan, dipurifikasi, dan dipresipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball, 1990).

Daftar pustaka

Anonim.2011.Mengenal PCR Polimerase Chain Reaction.Diakses dari sumber http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chainreaction/ pada tanggal 12 Mei 2011.

Anonim.2011.Mutasi.Diakses dari sumber http://biologimediacentre.com/mutasi/ pada tanggal 12 Mei 2011.

Campbell, N.A, Jane B. Reece, Lawrence G, Mitchell. 2000. Biology, Fifth Edition.Jakarta:Erlangga.

Ganong, W.1997. Fisiologi Kedokteran.Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Hardjosubroto, Wartomo. 1998. Pengantar Genetika Hewan. Fakultas Peternakan Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Kimball, John W. 1990. Biologi. ter. Siti Soetarmi dan Nawangsari. S. PT. Gelora Aksara Pratama. Bandung.

Suryo.1994. Genetika Strata 1. Cetakan ke 4.Gadjah Mada University Press.